SECUENCIACIÓN DEL ADN

1.- ¿En qué consiste la secuenciación del ADN? ¿Qué utilidades tiene?
La secuenciación consiste en un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas que nos permiten determinar el orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en el ADN.

Sus posibles utilidades son:

· Detección de mutaciones

· Análisis de ADN de fósiles

· Diagnóstico de enfermedades genéticas

· Identificación de especies y control de cruces entre animales

· Investigación forense

· Bioseguridad: detección de enfermedades infecciosas

· Detección de patógenos en alimentos

· Análisis de paternidad



2.- ¿Con qué aparato se hace? ¿Qué es lo que se obtiene?
Actualmente el proceso es automático y requiere un equipo que llamamos "secuenciador" por la labor que hace, pero el nombre correcto es Analizador Genético. Por razones operativas se suelen analizar cadenas de ADN de unos 500 nucleótidos como máximo.

El precio de estos equipos es variable, ya que los hay de muchos tipos. Pero algo parecido a lo que tenemos en la Universidad -que ya no se fabrica, aunque todavía quedan en stock y se siguen vendiendo- es de unos 100.000 €.

  
Secuenciador

Una vez introducida la muestra, el proceso analítico es automático. El análisis de una muestra en nuestro equipo tiene una duración de 2 h y 45 min. Se obtiene una representación gráfica cuatricolor.



La representación de colores está normalizada y siempre se utiliza el rojo para la T, el azul para la C, el negro para la G y el verde para la A.





3.- ¿Puede citar algunos descubrimientos importantes relacionados con el ADN?
En 1944 los científicos Avery, McLeod y McCarty identificaron el ADN como el principio transformante de Griffith en la transformación bacteriana. Este descubrimiento supuso el “nacimiento” del ADN como la molécula responsable de portar la carga genética en la célula.

En 1953 se descubrió la estructura del ADN (Watson, Crick y Wilkins fueron galardonados con el Nobel de Medicina en 1962). El modelo estructural del ADN constituía una doble hélice en la que ambas cadenas se orientaban en direcciones antiparalelas y mostraba el emparejamiento de las bases: A con T y G con C.

En los años posteriores, los descubrimientos de Meselson y Stahl (con respecto al proceso semiconservativo de replicación del ADN), los de Arthur Kornberg y Severo Ochoa (Nobel de Medicina en 1959), así como los de Holley, Nirenberg y Khorana (Nobel de Medicina en 1968), dan como resultado el esclarecimiento del código genético en 1966.

Durante los diez años siguientes se suceden los trabajos encaminados a la dilucidación de la regulación de la expresión génica y la colinearidad entre genes y sus productos proteicos.



4.- ¿Puede comentar el modelo estructural del ADN?

La estructura de una molécula de ADN dada viene definida por la secuencia de bases nitrogenadas en la cadena nucleotídica, residiendo en esta secuencia de bases la información genética del ADN. Así, resulta de vital importancia para la célula el orden en el que se encuentran las cuatro bases a lo largo de una cadena de ADN, ya que es precisamente este orden el que constituye las instrucciones del programa genético de los organismos. Por lo que secuenciar una molécula de ADN, es decir, establecer el orden en el que las diferentes bases se encuentran en la cadena, equivale a descifrar su mensaje genético.

El apareamiento condicionado de las bases en el ADN conlleva que el orden de una de las cadenas define automáticamente el orden de la otra. Por ello se dice que las cadenas de nucleótidos son complementarias.





5.- ¿Cuándo estuvo perfeccionada la técnica para secuenciar el ADN?

Fue en 1977 cuando el biólogo molecular británico Frederick Sanger (galardonado con el Nobel de Química en 1980, junto con Walter Gilbert y Paul Berg) desarrolla y publica las técnicas de secuenciación del ADN, mediante el que pasaría a conocerse como método de los terminadores de cadena o dideoxi (didesoxi).

En 1986 este método es mejorado por el biólogo molecular estadounidense Leroy Hood con la automatización de las etapas de secuenciación del ADN y el análisis computarizado de los geles obtenidos, incorporando ordenadores y láser en el proceso.



6.- ¿Cuál fue el método inicial de secuenciación del ADN?
A finales de la década de 1970 se desarrollaron dos métodos que permitían la secuenciación de una molécula de ADN de una manera sencilla y rápida. Al principio, la idea consistía en imitar los clásicos métodos de secuenciación de proteínas, donde las moléculas eran fragmentadas y analizada su composición en función de sus características físico-químicas, deduciendo así su secuencia a partir de fragmentos solapantes.

Pero este método, que para proteínas resultaba muy eficaz, mostró sus carencias a la hora de analizar una molécula resultante de la combinación de cuatro nucleótidos diferentes. Así, en 1977, los grupos de A. Maxam y W. Gilbert por un lado, y de F. Sanger por otro, desarrollaron sendos métodos de secuenciación específicos para el ADN.



7.- ¿En qué consiste el método químico de Maxam y Gilbert?

En este método se usa fósforo radiactivo para marcar el ADN. Una vez marcado, el ADN se fracciona con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases. Cuatro alícuotas de la misma muestra se tratan bajo condiciones distintas y, posteriormente, un tratamiento con piperidina rompe la molécula a nivel de la base modificada. Los productos así obtenidos son separados en geles de poliacrilamida en función de su tamaño.



8.- ¿En qué consiste el método enzimático de Sanger?

Este método también es conocido como método de los terminadores de cadena o dideoxi, y se basa en el uso de dideoxinucleótidos (ddNTP) que se diferencian de los deoxinucleótidos (dNTP) en que carecen del grupo –OH en el carbono 3´de la ribosa.




En este –OH del carbono 3´de la ribosa es precisamente donde la enzima incorpora el siguiente nucleótido de la cadena que se está sintetizando, formando un enlace fodfoéster. Al carecer de grupo –OH, tras la incorporación a la cadena de un ddNTP, el proceso de replicación se termina ya que no se permite la incorporación de un nuevo nucleótido.

A efectos prácticos lo que se hace es diseñar un oligonucleótido de entre 18-25 bases complementario a una zona de la cadena de ADN que se quiere secuenciar. Tras unirse este oligonucleótido al ADN molde, la ADN polimerasa I va a extender la cadena desde el grupo OH libre del extremo 3´ del oligonucleótido mediante la incorporación de dNTPs complementarios al molde de ADN (ver nota).

La reacción de secuenciación se da en cuatro alícuotas de la misma muestra en las que se darán sendas reacciones de síntesis incluyendo cada alícuota pequeñas cantidades de los cuatro diferentes ddNTPs (ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP). La incorporación a la cadena replicada de uno de estos nucleótidos (en inhibición competitiva con el correspondiente dNTP), da lugar a una mezcla de cadenas de distintas longitudes acabando en todas las diferentes posiciones posibles donde un ddNTP es incorporado en lugar de un dNTP.

Sustituyendo uno de los dNTPs por el mismo nucleótido marcado radiactivamente podemos visualizar las bandas de diferente tamaño separadas en un gel de poliacrilamida, ocupando cada una de las reacciones un carril.






9.- En unos libros se escribe dideoxinucleótidos y en otros, didesoxinucleótidos. ¿Es lo mismo dideoxi que didesoxi?

La ribosa integra el ARN, y la desoxirribosa, el ADN. En español, ADN son las siglas del ácido desoxirribonucleico, que en inglés se escribe “deoxyribonucleic acid” (DNA). Desoxi y deoxi son prefijos sinónimos.

Cuando la ribosa pierde 2 oxígenos, en sendos grupos OH (posiciones 2 y 3 del anillo pentagonal o furanósico), se habla de didesoxirribosa, o bien, dideoxirribosa. Al considerar nucleótidos, se utiliza indistintamente el término dideoxinucleótido o didesoxinucleótido.

Dideoxi y didesoxi se emplean indistintamente en español, aunque lo etimológicamente correcto sería decir didesoxi. Lo que pasa es que dideoxi -igual que DNA en lugar de ADN- es un término que se ha tomado tal cual y nadie se preocupa por la traducción sino por el significado de la palabra en sí.



10.- ¿Cuándo empezó a utilizarse la secuenciación automática? ¿En qué consiste?
A finales de la década de los 80, con la automatización de las etapas de secuenciación del ADN y el análisis computarizado de los geles obtenidos, gracias a la incorporación de ordenadores y láser en el proceso, apareció la secuenciación automática.

Realmente se trata de una modificación del método de Sanger. Dicha modificación radica en el hecho de que aquí el marcaje no es radiactivo sino por fluorescencia (bien del oligonucleótido cebador, bien de los terminadores), y en que los productos de la reacción se detectan directamente durante la electroforesis gracias a un láser que capta la fluorescencia emitida por los fluoróforos excitados.



11.- ¿Qué variantes (o métodos alternativos) suelen emplearse en la secuenciación automática?

• Secuenciación mediante el uso de cebadores fluorescentes. En este método se llevan a cabo cuatro reacciones de secuencia, añadiendo en cada una de ellas el oligonucleótido marcado con una sonda fluorescente diferente y un ddNTP distinto. Por último, se mezclan las cuatro reacciones en un solo tubo y se carga éste en el secuenciador automático.
• Secuenciación mediante el uso de terminadores fluorescentes. En este caso se lleva a cabo una única reacción de secuenciación en presencia de los cuatro ddNTPs, cada uno de ellos marcados con una sonda fluorescente distinta.

12.- ¿En qué año se logró secuenciar el genoma humano?

En 1990, un grupo de científicos, con J. Watson a la cabeza, lanzan el proyecto de cartografiar y secuenciar el genoma humano gracias a las modernas técnicas de secuenciación automática, aunque ya en 1986 el Nobel francés Renato Dulbecco vaticinaba en un artículo publicado en el número 231 de la revista Science, que sería necesario secuenciar el genoma humano completo para abordar con eficacia la lucha contra el cáncer.

En 1995 ya se había secuenciado el primer genoma completo de un organismo: Mycoplasma genitalium. En 1999 se consiguió la secuencia completa del primer cromosoma humano, el 22.

El 26 de junio de 2000, Bill Clinton, Tony Blair y los dos responsables científicos del proyecto de secuenciación del genoma humano, Craig Venter y Francis Collins, anuncian que habían conseguido secuenciar de manera completa el genoma humano gracias a la técnica de “Shotgun”, consistente en dividir en millones de fragmentos el genoma humano y secuenciar éstos por separado; a continuación, un complejo programa informático llamado Assembler se encargaría de juntar los fragmentos del “puzzle” para darle forma.



13.- ¿Qué es la secuenciación de alto rendimiento?

Esta técnica no tiene nada que ver con todo lo anterior y el más conocido de estos métodos es el llamado pirosecuenciación o secuenciación 454. La pirosecuenciación utiliza una técnica basada en una enzima llamada luciferasa y, como podéis imaginar, hay mucho más trabajo bioinformático que puramente bioquímico.

Los mejores equipos de "secuenciación estándar" -usando terminadores y capilares- son capaces de analizar entre 50.000 y 100.000 nucleótidos en una hora. Con la pirosecuenciación se pueden secuenciar unos 5 millones de nucleótidos cada hora. Con estos nuevos equipos ya hay empresas que secuencian el genoma de un humano sólo en un par de semanas y por un coste de unos 3.000 €. El precio de estos equipos excede -y en mucho- esos 100.000 € de los que hablábamos arriba. En este caso ya estaríamos hablando de algunos millones de euros. Por supuesto, aquí en la Ual carecemos de esos equipos, pero en España ya hay 4 ó 5, y por lo que yo sé dan muy buenos resultados.

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