1.- ¿Qué son las restrictasas o enzimas de restricción?
Las restrictasas o enzimas de restricción son proteínas de origen bacteriano que reconocen una determinada secuencia nucleotídica, llamada sitio o diana de restricción, y cortan el ADN en esa secuencia o en una región adyacente (rompen un enlace fosfodiéster liberando un extremo 5’P y otro 3’OH). Los trozos de ADN resultantes, llamados fragmentos de restricción, pueden separarse mediante electroforesis sobre geles.
2.- ¿Cómo se descubrieron las enzimas de restricción?
En 1970 se observó que algunos virus bacteriófagos infectaban y lisaban algunas cepas de la bacteria Escherichia coli pero no otras, las cuales se mostraban resistentes. Esto se debía a que en ellas había enzimas que cortaban en trozos el ADN del fago infectante, antes de que pudiera replicarse o transcribirse, interrumpiendo el ciclo lítico del virus. A tales enzimas se les dio el nombre de restrictasas o enzimas de restricción y con su descubrimiento se inició la ingeniería genética.
Dado que estas enzimas cortan el ADN cuando encuentran su secuencia específica a lo largo de la doble hélice y no en sus extremos (como harían las exonucleasas), se denominan también endonucleasas de restricción, pues además “restringen” el ciclo vital de los bacteriófagos.
3.- ¿Cómo se pueden separar los fragmentos de restricción?
Mediante electroforesis sobre geles, ya que el ADN se mueve hacia el polo positivo debido a las cargas negativas de los grupos fosfato. Los fragmentos grandes se desplazan lentamente a través de los poros del gel, mientras que los pequeños se mueven más rápidamente en el campo eléctrico. Después de la electroforesis, la comparación de los tamaños de los fragmentos obtenidos en el experimento, con fragmentos de ADN de magnitud conocida, permite estimar el tamaño de cualquier fragmento de ADN.
4.- Consulte su libro de texto o alguna dirección de internet (por ejemplo, “rebase.neb.com”) y escriba el nombre de las bacterias utilizadas para obtener las siguientes restrictasas: a) EcoRI, b) BsuRI, c) HaeIII.
(a) = Escherichia coli (b) = Bacillus subtilis (c) = Haemophilus aegytius
5.- ¿Qué significado tienen las tres primeras letras del nombre de una enzima de restricción (por ejemplo, TaqI)?
Es un acrónimo del nombre científico de la especie bacteriana de la que proviene la enzima. La primera letra (siempre con mayúscula) corresponde al género y las otras dos, al término específico. Por ejemplo, la restrictasa TaqI se obtiene de Thermus aquaticus.
Aunque lo correcto es poner las tres primeras letras en cursiva, puesto que derivan del nombre científico, muchos libros y páginas de internet no lo hacen y escriben, por ejemplo, TaqI en lugar de TaqI.
Por añadidura, lo restante alude a la cepa bacteriana y el número (romano) indica el orden del descubrimiento. La 1ª restrictasa descubierta en la cepa RY13 de Escherichia coli se designa como EcoRI. Otro ejemplo: HindIII fue la 3ª en aislarse de Haemophilus influenzae, cepa Rd.
6.- Si el punto de corte de EcoRI está señalado en una cadena de ADN por la marca (^), indíquelo en la cadena complementaria de esta secuencia de reconocimiento: 5’- G^A A T T C - 3’.
Hay que tener en cuenta la complementariedad de las bases (A-T , G-C) y que las cadenas del ADN son antiparalelas: 3’- C T T A A^G - 5’.
7.- ¿Qué entiende por extremos adherentes o cohesivos? ¿Son importantes?
Las enzimas de restricción actúan como “tijeras moleculares” que reconocen una secuencia nucleotídica concreta (diana de restricción). Si el corte no se produce en el centro de esa diana, al cortar el ADN queda en cada extremo un pequeño trozo de hebra monocatenaria formada por las bases de la secuencia de reconocimiento. Estos extremos, llamados adherentes o cohesivos, son importantes pues permitirán que distintas moléculas de ADN, tratadas con una misma restrictasa, formen enlaces de hidrógeno, según la complementariedad de las bases, y tiendan a juntarse. La ADN ligasa completa la unión al restablecer el enlace fosfodiéster. Este ADN recombinante es uno de los fundamentos para las experiencias de ingeniería genética.
Formación de ADN recombinante: unión de dos fragmentos de ADN de distinta procedencia obtenidos tras cortar con EcoRI y unir con ADN ligasa.
10.- ¿Qué son mapas de restricción?
Comparando los fragmentos de restricción formados a partir de una región determinada de ADN, sometida a la acción de varias restrictasas, se puede calcular la posición de cada sitio de restricción en relación con los demás. Un mapa de restricción es, pues, la representación gráfica de un trozo de ADN que muestra la localización de cada punto de corte de las restrictasas utilizadas y la distancia entre ellos en pares de bases.
11.- Se tiene un ADN de 8 kb que presenta un único sitio o diana de restricción para EspI. ¿Cuántos fragmentos de restricción resultarían al ser tratado con ella?
Si el ADN es circular, al ser cortado por EspI, se obtendría un solo segmento lineal de 8 kb, pero si el ADN inicial fuera lineal resultarían 2 fragmentos de tamaños dependientes del lugar en que se encuentre la diana de restricción (por ejemplo, 3 kb y 5 kb).
12.- ¿Por qué las enzimas de restricción de una bacteria no cortan el ADN de la propia célula bacteriana?
El ADN de la propia bacteria no es atacado porque los sitios o secuencias que reconoce la restrictasa han sido modificados (metilados) en el ADN bacteriano por enzimas de modificación, de forma que la enzima de restricción no reconoce la diana modificada.
13.- Cuando en una experiencia de ingeniería genética se introduce en la bacteria ADN recombinante, siendo por tanto extraño para la célula, ¿será destruido por las propias enzimas de restricción?
Es lo más probable, pero para evitar tal circunstancia, que malograría el experimento, se utilizan bacterias mutantes carentes de enzimas de restricción.
14.- ¿Qué es la ingeniería genética y cuáles son las “herramientas” o técnicas imprescindibles?
La ingeniería genética es un conjunto de tecnologías que permiten conocer y modificar el genoma de un organismo. Son imprescindibles: a) las enzimas de restricción, que actúan como “tijeras moleculares” y cortan el ADN por lugares específicos; b) ADN ligasa, necesaria para unir o “pegar” los fragmentos de ADN de distinta procedencia (tratados con la misma restrictasa para generar extremos cohesivos), originando un ADN “híbrido” o ADNrec (recombinante); c) un “vector” para trasladar este ADN recombinante al interior del organismo receptor, siendo muy utilizados como vectores los plásmidos bacterianos; d) la reacción en cadena de la polimerasa se ha convertido en los últimos años en una de las técnicas imprescindibles en este tipo de experimentaciones.
15.- ¿Qué son plásmidos?
Los plásmidos son moléculas circulares de ADN bicatenario que hay en algunas bacterias como material con capacidad para replicarse de modo autónomo respecto del ADN principal o “cromosoma” bacteriano. En ingeniería genética se utilizan plásmidos como vectores para multiplicar el ADN exógeno. Los plásmidos usados en ingeniería genética suelen contener genes de resistencia a antibióticos y son del menor tamaño posible para que sean eficientemente incorporados.
16.- Si un plásmido convenientemente modificado se adiciona a un cultivo bacteriano, ¿cómo se podrá saber qué bacterias lo han incorporado?
El plásmido debe contener al menos un gen selectivo que permita la selección de las bacterias que lo portan. De esta forma, si un plásmido contiene un gen que codifica para una proteína que degrade un determinado antibiótico (por ejemplo, ampicilina), al añadirlo al cultivo sólo sobreviven las bacterias que han incorporado el plásmido en cuestión. Al cabo de pocas horas toda la descendencia originada, portadora del plásmido, será resistente y expresará el producto génico que se pretende.
17.- A y B son restrictasas. La acción de A sobre una molécula de ADN lineal de 10 kb genera dos fragmentos, de 4 kb y 6 kb. La acción de B da como resultado también dos trozos, de 1 kb y 9 kb. La acción conjunta de A y B sobre el ADN genera tres fragmentos de restricción, 4 kb, 1 kb y 5 kb. ¿Podría dar una explicación?
La diana de restricción de A está a una distancia de 4000 pares de bases (4 kb) de un extremo. La diana de la enzima B estaría a 1000 pb (1 kb) del otro extremo.
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